A-2.PCR产物测序出现双峰现象，一般有以下几种原因：

      (1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是双峰。

      (2) 结构上的原因，造成了PCR产物测序出现双峰的现象。PolyA/T G/C以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果双峰的情况。

A-3.在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成双峰的形成，归结其形成原因有以下几点：

      (1) 测序引物在模板上有两个结合位点形成双峰。

      (2) 模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带。

      (3) 模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等。

      (4) 引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好。

A-4.如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现双峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。 对这些结果，公司会根据具体测序情况进行收费。出现这些情况的原因分析如下：

      (1) G/C rich、G/C Cluster：这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失；

      (2) A、T的连续结构：这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现双峰。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打滑现象），造成测序结果紊乱，出现双峰。出现这样的情况，建议反向测序。

      (3) 原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行

A-5.出现这样的情况只有两种可能：

      (1) 可能是空载体,没有装进去目的片段。

      (2) 您的样品插入部分与您预期的不一致。

A-6(1) 如果您提供的是PCR样品，在测序报告上找不到您的引物序列是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没 有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。实际上不但测序引物无法识别，而且由于目前测序技术的局限性，紧靠测序引物一侧的30～50个bp通常也无法100％识别，如果需要验证这个区域的碱基序列或者测序引物本身的序列，就需要用另一侧引物进行反向测序。

A-6 (2) 您提供的是质粒或菌液样品,使用通用引物测序，找不到您的PCR引物可能是因为您的PCR引物距离载体的通用引物位点过近，由于测序反应在距离起始位点30-50bp内的结果可信度不高，因此会影响您正确读取您的PCR引物序列。

A-7(1) 长度为1Kb的DNA模板需要两个测序反应，才有可能得到完整准确的读长，对于1.6kb以上的DNA片断，在两个反应后还需要设计合成测序引物，测序后拼接出全长，对于这些测序引物，我们将按碱基个数收取引物合成费用。

A-7(2) 测通需要的时间。

      a.如有预期片段的序列，可以一次做设计好引物做出实验方案， 2-5天发送结果；

      b.如没有预期的序列，可以从两端设计引物直至测通，每次加测一次预计24小时。